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《Biomaterials》：3D打印具有肝脏细胞和静脉结构的肝脏类器官
更新时间：2024-07-25 16:08:55
当代医学研究的前沿，3D生物打印技术正以其革命性的潜力，重塑我们对器官再生和移植的认知。
肝脏作为人体的重要器官，具有复杂的生理功能，包括代谢、解毒、合成蛋白质等。然而，传统的3D打印技术在打印具有复杂结构和功能的肝脏组织方面存在诸多挑战。为了克服这些挑战，科学家们一直在探索新的打印技术和材料。
最近，北京协和医院肝脏外科教授毛一雷、杨华瑜团队携手牛津大学生物医学工程研究所/牛津大学高等研究院 (苏州) 叶华团队、中国医学科学院生物医学工程研究所/天津医学健康研究院黄鹏羽团队，在《Biomaterials》期刊上发表了他们的开创性研究。
研究团队开发了一种名为“全方位打印嵌入式网络（OPEN）”的新型支撑介质，成功打印出具有肝脏细胞和静脉结构的肝脏类器官（HEALs），HEALs在移植后显著促进了内源性血管新生，这对于提高移植器官的存活率和功能恢复具有重要意义。
合成方法：
1、支撑介质OPEN的制备：
研究者开发了一种新型的支撑介质OPEN，利用Pluronic® F-127 (PF127) 和改性羟丙甲纤维素 (H-HPMC) 通过疏水作用形成网络结构。通过调整PF127和H-HPMC的比例，优化了OPEN的流变学特性，确保其在室温到体温范围内具有稳定的固体特性和可调节的模量。
2、细胞的分离与培养
从小鼠中分离出主要肝细胞（PMHs），并采用特定的培养基诱导其形成肝细胞球体。同时培养了内皮细胞系C166，用于后续的血管结构打印。
3、生物墨水的制备
将GelMA（一种光交联的胶原蛋白类似物）与细胞混合，形成适合3D打印的生物墨水。根据打印需要，调整了GelMA、光引发剂LAP以及细胞的浓度。
4、3D打印
使用3D打印机（BioMaker 2, SunP Biotech）进行打印，打印机和打印床的温度分别设置为20°C和30°C。打印路径根据肝脏解剖学设计，采用格子状和圆形路径分别打印肝脏实质和血管结构。
5、打印后处理
打印完成后，使用紫外线照射固定打印结构。将打印结构转移到含有α-CD（一种有效的去除剂）的溶液中，以去除OPEN支撑介质。
体外表征：
A. 通过特定的培养条件，肝细胞能够自发聚集形成球体，这是模拟肝脏自然结构的重要步骤。B. 活/死染色实验显示，在体外培养10天后，肝细胞的存活率超过90%，21天后存活率仍高于80%。这表明打印的肝细胞在体外环境中具有较高的生存能力。C. 共聚焦图像显示肝细胞球体具有典型的多边形形态，这是功能性肝细胞的特征之一。D. 通过免疫荧光染色检测了肝细胞球体中特定肝细胞标记物的表达，如白蛋白（ALB）和α1-抗胰蛋白酶（AAT）。肝细胞球体在培养10天后显示出高ALB和AAT的荧光，表明它们具有肝脏功能。E. 糖原储存的PAS染色结果显示肝细胞球体能够储存糖原，这是肝细胞正常功能的重要指标。F. 低密度脂蛋白摄取的Dil-ac-LDL荧染色结果表明肝细胞球体能够摄取并储存低密度脂蛋白，进一步证实了它们的肝脏功能。G. ICG摄取和释放实验显示肝细胞球体能够在6小时内摄取并释放ICG，表明它们具有正常的肝脏代谢功能。H. 通过定量实时聚合酶链反应（qPCR）分析了肝细胞球体中肝细胞特异性基因的表达。与新鲜分离的PMHs相比，HEAL中的PMHs在10天培养后，ALB和AAT基因表达水平为新鲜PMHs的40%，而Fpn、Krt8和Krt18等其他肝细胞标记基因在HEAL中的表达水平显著高于2D和3D培养条件，表明HEAL中的肝细胞球体具有更好的肝功能。I. 主成分分析（PCA）结果显示，HEAL样本的基因表达模式与新鲜分离的PMHs相似，表明HEAL中的肝细胞球体在基因表达水平上更接近于自然肝细胞。J. 基因表达热图展示了与肝发育和肝形态发生相关的基因在PMHs、HEAL、2D和3D培养条件下的表达热图。热图显示HEAL中的肝细胞球体在关键肝细胞转录因子和代谢相关基因的表达上与新鲜PMHs相似，而2D和3D培养条件下的PMHs则表现出显著差异。
体内移植后新生血管情况
A. 新生血管的示意图展示了通过保留肝细胞球体装载层之间的空隙促进内源性新生血管。这种设计利用了打印结构中的空隙，为血管新生提供了空间，从而有助于血管从宿主组织向移植的肝脏组织生长。B. 移植后血管化的HEAL的明场图像展示了移植后14天的血管化HEAL的明场图像，显示了在打印格子结构的自由空间上的血管生成。图像显示了在HEAL结构中形成了丰富的血管网络，这表明移植的肝脏组织能够与宿主的血管系统相连，从而获得必要的营养和氧气。C. 通过尾部注射荧光地克司蓝，展示了功能性新血管。荧光图像清晰显示了新形成的血管网络，证明了这些血管是功能性的，能够运输血液和营养物质。D. AAT阳性移植部分的新血管荧光图像展示了在AAT（α1-抗胰蛋白酶）阳性移植部分上的新血管的荧光图像。AAT是一种肝脏特异性蛋白，其阳性区域表明这些新血管与肝脏组织相连，进一步证实了血管新生的成功。E. 血管密度和总血管长度的定量展示了有无静脉结构的HEAL的血管密度和总血管长度的定量结果。数据表明，包含静脉结构的HEAL在平均血管密度和总血管长度上均显著高于仅打印肝脏结构的HEAL，这表明静脉结构的引入显著促进了血管新生。F-G. 肝细胞和血管标记物的共聚焦图像显示了肝细胞和新血管的共存，表明这些新血管不仅形成了，而且与肝脏细胞紧密相连，这对于肝脏功能的维持至关重要。H. 血管标记物CD31的共聚焦图像展示了在血管标记物CD31阳性移植组分上的新血管的共聚焦图像。CD31是一种内皮细胞标记物，其阳性区域表明新血管的形成是由内皮细胞的增殖和迁移驱动的。I.通过CD31和ALB免疫组化染色，确认了移植后2周内HEAL中维持的肝脏功能和显著的新生血管。免疫组化染色结果进一步证实了HEAL在移植后不仅保持了肝脏功能，还成功促进了血管新生，这对于移植肝脏的长期存活和功能至关重要。
结论
研究结果表明，利用OPEN和生物墨水打印的HEALs不仅在体外具有生物活性，而且在体内移植后能够促进血管新生，维持肝脏功能。这为肝脏疾病治疗和器官移植提供了新的治疗方法。
尽管取得了显著进展，但研究者也指出，HEALs的结构和功能与真实肝脏相比仍有差距。未来的研究需要进一步优化打印技术、生物墨水和多细胞共培养系统，以更好地模拟肝脏的微环境和功能。
肝脏作为人体的重要器官，具有复杂的生理功能，包括代谢、解毒、合成蛋白质等。然而，传统的3D打印技术在打印具有复杂结构和功能的肝脏组织方面存在诸多挑战。为了克服这些挑战，科学家们一直在探索新的打印技术和材料。
最近，北京协和医院肝脏外科教授毛一雷、杨华瑜团队携手牛津大学生物医学工程研究所/牛津大学高等研究院 (苏州) 叶华团队、中国医学科学院生物医学工程研究所/天津医学健康研究院黄鹏羽团队，在《Biomaterials》期刊上发表了他们的开创性研究。
研究团队开发了一种名为“全方位打印嵌入式网络（OPEN）”的新型支撑介质，成功打印出具有肝脏细胞和静脉结构的肝脏类器官（HEALs），HEALs在移植后显著促进了内源性血管新生，这对于提高移植器官的存活率和功能恢复具有重要意义。
合成方法：
1、支撑介质OPEN的制备：
研究者开发了一种新型的支撑介质OPEN，利用Pluronic® F-127 (PF127) 和改性羟丙甲纤维素 (H-HPMC) 通过疏水作用形成网络结构。通过调整PF127和H-HPMC的比例，优化了OPEN的流变学特性，确保其在室温到体温范围内具有稳定的固体特性和可调节的模量。
2、细胞的分离与培养
从小鼠中分离出主要肝细胞（PMHs），并采用特定的培养基诱导其形成肝细胞球体。同时培养了内皮细胞系C166，用于后续的血管结构打印。
3、生物墨水的制备
将GelMA（一种光交联的胶原蛋白类似物）与细胞混合，形成适合3D打印的生物墨水。根据打印需要，调整了GelMA、光引发剂LAP以及细胞的浓度。
4、3D打印
使用3D打印机（BioMaker 2, SunP Biotech）进行打印，打印机和打印床的温度分别设置为20°C和30°C。打印路径根据肝脏解剖学设计，采用格子状和圆形路径分别打印肝脏实质和血管结构。
5、打印后处理
打印完成后，使用紫外线照射固定打印结构。将打印结构转移到含有α-CD（一种有效的去除剂）的溶液中，以去除OPEN支撑介质。
体外表征：
A. 通过特定的培养条件，肝细胞能够自发聚集形成球体，这是模拟肝脏自然结构的重要步骤。B. 活/死染色实验显示，在体外培养10天后，肝细胞的存活率超过90%，21天后存活率仍高于80%。这表明打印的肝细胞在体外环境中具有较高的生存能力。C. 共聚焦图像显示肝细胞球体具有典型的多边形形态，这是功能性肝细胞的特征之一。D. 通过免疫荧光染色检测了肝细胞球体中特定肝细胞标记物的表达，如白蛋白（ALB）和α1-抗胰蛋白酶（AAT）。肝细胞球体在培养10天后显示出高ALB和AAT的荧光，表明它们具有肝脏功能。E. 糖原储存的PAS染色结果显示肝细胞球体能够储存糖原，这是肝细胞正常功能的重要指标。F. 低密度脂蛋白摄取的Dil-ac-LDL荧染色结果表明肝细胞球体能够摄取并储存低密度脂蛋白，进一步证实了它们的肝脏功能。G. ICG摄取和释放实验显示肝细胞球体能够在6小时内摄取并释放ICG，表明它们具有正常的肝脏代谢功能。H. 通过定量实时聚合酶链反应（qPCR）分析了肝细胞球体中肝细胞特异性基因的表达。与新鲜分离的PMHs相比，HEAL中的PMHs在10天培养后，ALB和AAT基因表达水平为新鲜PMHs的40%，而Fpn、Krt8和Krt18等其他肝细胞标记基因在HEAL中的表达水平显著高于2D和3D培养条件，表明HEAL中的肝细胞球体具有更好的肝功能。I. 主成分分析（PCA）结果显示，HEAL样本的基因表达模式与新鲜分离的PMHs相似，表明HEAL中的肝细胞球体在基因表达水平上更接近于自然肝细胞。J. 基因表达热图展示了与肝发育和肝形态发生相关的基因在PMHs、HEAL、2D和3D培养条件下的表达热图。热图显示HEAL中的肝细胞球体在关键肝细胞转录因子和代谢相关基因的表达上与新鲜PMHs相似，而2D和3D培养条件下的PMHs则表现出显著差异。
体内移植后新生血管情况
A. 新生血管的示意图展示了通过保留肝细胞球体装载层之间的空隙促进内源性新生血管。这种设计利用了打印结构中的空隙，为血管新生提供了空间，从而有助于血管从宿主组织向移植的肝脏组织生长。B. 移植后血管化的HEAL的明场图像展示了移植后14天的血管化HEAL的明场图像，显示了在打印格子结构的自由空间上的血管生成。图像显示了在HEAL结构中形成了丰富的血管网络，这表明移植的肝脏组织能够与宿主的血管系统相连，从而获得必要的营养和氧气。C. 通过尾部注射荧光地克司蓝，展示了功能性新血管。荧光图像清晰显示了新形成的血管网络，证明了这些血管是功能性的，能够运输血液和营养物质。D. AAT阳性移植部分的新血管荧光图像展示了在AAT（α1-抗胰蛋白酶）阳性移植部分上的新血管的荧光图像。AAT是一种肝脏特异性蛋白，其阳性区域表明这些新血管与肝脏组织相连，进一步证实了血管新生的成功。E. 血管密度和总血管长度的定量展示了有无静脉结构的HEAL的血管密度和总血管长度的定量结果。数据表明，包含静脉结构的HEAL在平均血管密度和总血管长度上均显著高于仅打印肝脏结构的HEAL，这表明静脉结构的引入显著促进了血管新生。F-G. 肝细胞和血管标记物的共聚焦图像显示了肝细胞和新血管的共存，表明这些新血管不仅形成了，而且与肝脏细胞紧密相连，这对于肝脏功能的维持至关重要。H. 血管标记物CD31的共聚焦图像展示了在血管标记物CD31阳性移植组分上的新血管的共聚焦图像。CD31是一种内皮细胞标记物，其阳性区域表明新血管的形成是由内皮细胞的增殖和迁移驱动的。I.通过CD31和ALB免疫组化染色，确认了移植后2周内HEAL中维持的肝脏功能和显著的新生血管。免疫组化染色结果进一步证实了HEAL在移植后不仅保持了肝脏功能，还成功促进了血管新生，这对于移植肝脏的长期存活和功能至关重要。
结论
研究结果表明，利用OPEN和生物墨水打印的HEALs不仅在体外具有生物活性，而且在体内移植后能够促进血管新生，维持肝脏功能。这为肝脏疾病治疗和器官移植提供了新的治疗方法。
尽管取得了显著进展，但研究者也指出，HEALs的结构和功能与真实肝脏相比仍有差距。未来的研究需要进一步优化打印技术、生物墨水和多细胞共培养系统，以更好地模拟肝脏的微环境和功能。
